293T细胞在培养的过程中的特别注意事项有哪些？

 HEK-293T细胞是293T（293tsA1609neo）细胞系（ATCC CRL-11268）的衍生物。细胞持续表达SV40抗原，该细胞常用于转染实验，转染效率较高。（转染一般以50%密度铺板，待细胞刚刚贴到皿壁上后（一般8-10小时），即可进行转染操作）

293T细胞的培养条件除了用DMEM（推荐iCell-0001）培养基；胎牛血清，10%；还要添加L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ； 双抗 1%等添加物，但是293T细胞在培养的过程中贴壁能力较弱，在培养过程中特别要注意：

先，293T细胞贴壁能力较弱，培养时可酌情使用预铺0.2%明胶的培养瓶/培养皿。wan全培养液中需添加热灭活胎牛血清。细胞生长不能过密，过密细胞容易脱落，脱落下来的细胞可以通过离心收集，使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后继续培养。

其次，如果发生293T细胞不贴壁，漂浮在培养基中的现象，请确认所使用的DMEM中碳酸氢钠浓度及培养箱中CO2浓度。并参考以下培养体系：

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氢钠配制而成，使用5％CO2培养箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氢钠配制而成，使用10％CO2培养箱。

当使用碳酸氢钠含量高的培养基时，必须将这些细胞在10％CO2中孵育，以便正确缓冲培养基。当培养基没有适当缓冲时，239T细胞虽然可以存活，但将无法粘附并保持漂浮在培养基中。

293T细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

1. 收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3. 将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的wan全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

293T细胞参考文献：

【1】Ding L, Zeng Q, Wu J, et al. Caveolin1 regulates oxidative stressinduced senescence in nucleus pulposus cells primarily via the p53/p21 signaling pathway in vitro[J]. Molecular Medicine Reports, 2017, 16(6): 9521-9527.

【2】邱进, 刘辉, 袁芳, 等. MEF2C 基因启动子区碱基突变对转录活性的影响[J]. 新疆医科大学学报, 2017, 40(5): 606-611.

【3】Geng F, Lu G F, Ji M H, et al. MicroRNA-26b-3p/ANTXR1 signaling modulates proliferation, migration, and apoptosis of glioma[J]. American journal of translational research, 2019, 11(12): 7568.