筛选稳定细胞株的两种方法

　　稳转细胞系（稳定表达细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后，通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的，由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一，传代过程中细胞的基因表达保持稳定。
 

　　

　　筛选稳定细胞株的两种方法：

　　

　　1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系

　　

　　对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。

　　

　　另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。

　　

　　2、病毒感染筛选稳定细胞株

　　

　　病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。

　　

　　稳定转染细胞株服务流程：

　　

　　1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。

　　

　　2、筛选浓度测定：以10-14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。

　　

　　3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。

　　

　　4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。

　　

　　5、抗生素筛选。

　　

　　6、鉴定筛选结果。