人表皮永生化细胞HACAT的传代方法都有哪些？

　　一、人表皮永生化细胞HACAT的培养步骤：

　　1、细胞复苏：将含有1ml细胞悬液的冷冻管在37℃水浴中摇晃解冻，加入5ml培养基混匀。1000rpm离心5分钟，弃上清，加入4-6ml*培养基吹匀。然后，将所有细胞悬液加入培养瓶中过夜培养（或将细胞悬液加入6cm培养皿中）培养过夜。第二天，更换液体并检查细胞密度。

　　2、细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可进行传代。
 

　　二、贴壁细胞可采用以下方法传代：

　　1、弃去培养上清液，用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。

　　2、在培养瓶中加入1-2ml消化液，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况。如果大部分细胞变圆脱落，迅速将其放回控制台，轻敲培养瓶数次，然后加入5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。

　　3、轻轻吹打细胞，待*脱落后吸出，1000rpm离心8-10分钟，弃上清，加1-2ml培养基吹匀。

　　4、按5-6ml/瓶加入培养液，将细胞悬液按1：2～1：5的比例分装到装有5-6ml培养液的新皿或瓶中。

　　

　　三、对于悬浮细胞，可采用以下方法进行传代：

　　方法1：收集人表皮永生化细胞HACAT，1000rpm离心8-10分钟，弃上清，加1-2ml培养基吹匀。将细胞悬液按1:2至1:5的比例分入装有8ml培养基的新培养皿或瓶中。

　　方法2：换一半介质即可。弃去一半培养基后，将剩余的细胞悬浮，将细胞悬浮液以1:2至1:3的比例分装到装有8ml培养基的新皿或瓶中。

　　三、细胞冷冻保存：细胞生长良好时可进行冷冻保存。贴壁细胞冷冻后弃去培养基加入少量胰蛋白酶。细胞变圆脱落后，离心收集。将它们以1000rpm离心8-10分钟以去除上清液。根据冷冻量加入血清和DMSO。冷冻比例为90%FBS+10%DMSO。

　　PS：如果客户收到2ml管状细胞人表皮永生化细胞HACAT，收到细胞后，用75%酒精喷洒整管消毒，放入超净台或安全柜，严格无菌操作；将管状细胞转移到T25培养瓶或6cm培养皿中，加入*培养基约5ml，混匀，放入培养箱过夜培养，然后检查细胞密度：如果密度不超过80%，换溶液以继续培养、继代培养或酌情冷冻。如果密度超过80%，可以直接通过（方法同上）。